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冬虫夏草虫草素的检测方法和临床应用科学实验

放大字体  缩小字体 发布日期:2014-02-23  来源:本站  作者:中国冬虫夏草网  浏览次数:1186
核心提示:冬虫夏草虫草素的检测方法和临床应用科学实验薄层层析法(TLC):薄层层析法具有可同时分离多个样品、分析成本低、对样品预处理 要求不高等特点。雷帮星等将虫草素待测样品与标准品置于已活化的薄层板上 (110oC活化 0.5h),待溶剂挥发后,在展开剂(氧仿 :乙酸乙酯 :异丙醇 :水 =8:2:6:0.3)中展 开。挥干展开剂,将其置于紫外线分析仪上 ,254nm显色,用 TLC一2400薄层色谱扫描
冬虫夏草虫草素的检测方法和临床应用科学实验

薄层层析法(TLC):薄层层析法具有可同时分离多个样品、分析成本低、对样品预处理要求不高等特点。雷帮星等将虫草素待测样品与标准品置于已活化的薄层板上(110oC活化0.5h),待溶剂挥发后,在展开剂(氧仿:乙酸乙酯:异丙醇:水=8:2:6:0.3)中展开。挥干展开剂,将其置于紫外线分析仪上,254nm显色,用TLC一2400薄层色谱扫描仪在254nm处扫描积分,用ImageDeeipher分析软件处理数据,就可以测定虫草素的含量。

高效液相色谱法(HPLC):高效液相色谱法具有分辨率高,速度快,重复性高,可反复使用,自动化操作,分析精度高等优点。张嘉等以HPLC测定虫草素含量,色谱条件为SymmetryC18(5m,4.6×150mm)色谱柱,流动相为磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲液(ph=6.8,加1%四氢呋喃),流速I.8mL/min,检测波长为260nm,进样量101xL,灵敏度1.O00AUFS,室温。

其他方法:有I-IPLC—ESI—MS法、毛细管区带电泳分离法等。黄兰芳等以甲醇为提取溶剂,采用选择性离子检测(SIM)和电喷雾离子化(ESI),色谱条件为ShimadzuVP—ODS色谱柱,流动相为水:甲醇:甲酸=94:5:1,以2一氯腺普为内标,测定天然和人工冬虫夏草中腺苷和虫草素的含量。周菊峰等采用同样的方法测定冬虫夏草及其代用品中腺苷和尿苷的含量。实验表明,天然冬虫夏草和替代物中,各组分的含量有差异,天然冬虫夏草腺苷和尿苷的含量明显低于其替代物中的含量,不同产地天然冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和尿苷的含量也有一定差别。孙迎节等采用毛细管区带电泳分离法测定四种不同的虫草中虫草素和腺苷的含量,采用0.025mol/L的硼砂(pH9.4)作为缓冲液,在电压为20kV和检测波长为258nm的条件下,四种虫草水提液中的虫草素和腺苷获得了基线分离,并具有良好的精密度和重现性.

2虫草素的临床应用

2.1调节免疫系统功能及抗肿瘤作用

人体免疫系统保护及修补作用。机体的免疫系统对内抵御肿瘤、清除老化坏死的细胞组织,对外抗击病毒、细菌等微生物感染。虫草素对免疫系统的作用是使其处于最佳状态,增加免疫系统细胞、组织数量,促进抗体产生,增加吞噬、杀伤癌细胞功能,调低某些免疫细胞的功能,避免免疫功能亢进而给机体带来伤害。能够极大地提高人外周血液单核细胞IL一1O的分泌和IL一10mRNA的表达,同时对诱导产生IL一2的植物血球凝集素和外周血液单核细胞扩增都有抑制作用,而抗IL—lO中性抗体也不能完全阻止虫草素对IL一2产生的抑制作用。虫草素可使成熟树突状细胞诱导调节性T细胞增殖,还能抑制细胞分裂、促进细胞的分化、改变胞膜上物质结构分布,对T淋巴细胞转化有促进作用。还可提高机体单核巨噬细胞系统的吞噬功能,激活巨噬细胞产生细胞毒素直接杀伤癌细胞。此外,虫草素还能抑制蛋白质激酶活性,抗核苷磷酸化酶糖基的裂解,对体液免疫有调节作用。通过研究国产虫草素抗小鼠迟发型超敏反应的作用及其免疫机制的实验,表明虫草素可能通过其他免疫调节作用对迟发型超敏反应引起的小鼠接触性皮炎发挥明显的抑制效应,效应与药物剂量有关,同时对脾脏组织未见明显毒性作用。

艾滋病治疗中的应用。HIV一1RT和HIV—lPR是抗艾滋病病毒药物研究的两个重要靶点。相关研究表明,已有的化学合成类抗HIV药物只能降低HIV感染者体内的病毒载量,而不能根治艾滋病,且价格昂贵,又有一定的毒副作用和耐药性变异病毒的出现,多数仅为短期有效,不能满足长期乃至终身用药的要求。因此天然药物虫草素备受关注。从虫草中分离纯化得到f1,f2和f3,并对它们的体外抗HIV一1tiT和HIV一1PR活性进行了研究,经过纯化后的n,和B对重组HIV一1逆转录酶活性均表现出一定的抑制作用.其原因可能是经过分离纯化后,三种物质影响HIV一1逆转录酶活性的基团或结构在没有其他组份的影响下发挥了抑制作用。

抗炎作用。Zhou等进行的体外实验,证实虫草素能通过促进人外周单核细胞白介素一10的分泌和白介素10mRNA的表达来参与抗炎反应。D~ong等发现虫草素能通过诱导调节性T细胞增殖来影响炎症反应。在Kim等的实验中,为了明确虫草素的抗炎机制,检测了脂多糖激活的RAW264.7巨噬细胞中Akt和MAP激酶的活性,在剂量依赖模式中,虫草素能显著抑制巨噬细胞中Akt和p38MAPK激酶的磷酸化,从而抑制了NF—KB从胞浆到核内的易位。除了通过抑制上述两种激酶而影响NF—KB外,虫草素还可以抑制转录因子抑制剂IKBMpha的磷酸化,延长其降解时间。虫草素通过抑制NF—KB的作用,导致iNOS和COX一2基因表达下调,使NO产物的生成减少,最终的结果是抑制了炎症反应。因此,可以推测虫草素通过影响众多细胞因子的表达而发挥抗炎作用,而其对NF—KB的抑制作用是其中关键的一环。药理研究表明,冬虫夏草可以促进白细胞的生成,恢复造血功能,提高机体的免疫能力。临床实践证明,服用冬虫夏草并合理应用其他药物,不仅能减轻放、化疗的反应,而且能使白细胞减少症得到有效的治疗。在西药治疗基础上加用冬虫夏草治疗白细胞症,可提高有效治疗率,且愈后不易复发,不良反应极小。

2.2抑制及杀伤肿瘤细胞作用

研究发现,用虫草素皮下注射接种艾氏腹水癌的小鼠,可使小鼠半数生存期延长到60d,而对照组仅为19d,说明虫草素对小鼠艾氏腹水癌有明显的抑制作用,能明显延长接种艾氏腹水癌小鼠的存活时间。还有研究表明,虫草素对人鼻咽癌KB细胞和人宫颈癌HeLa细胞等皆具有明显的抑制作用。

2.3肝脏功能调节作用

虫草素可减轻有毒物质对肝脏的损伤,对抗肝纤维化的发生。此外,通过调节免疫功能,增强抗病毒能力,对病毒性肝炎发挥有利的作用。

酒精性脂肪肝治疗作用。虫草菌丝能不同程度地减轻试验性大鼠酒精性肝脏的脂肪变性,证实虫草菌丝具有明显的抑制肝脏炎症的作用,可使ALT、AST显著降低。同时,虫草菌丝具有显著降低TG、TC水平,抑制TG合成,从而达到治疗酒精性脂肪肝的作用。虫草菌丝治疗可显著减轻肝脏炎症。张新星等研究表明,虫草菌丝可通过增加超氧化物歧化酶(SOD)活性来减少活性氧含量,降低Bax表达,增加Bcl一2表达和活化NF—KBp65,减轻NASH中肝细胞凋亡,从而在一定程度上有保肝功能,对延缓或阻止脂肪肝的进展起到一定的作用。

抗纤维化作用。动物实验证明,冬虫夏草乙醇提取物注射到小鼠腹腔能使脾脏重量增加,并可使核酸及蛋白质的含量增加、促进脾细胞DNA合成、淋巴细胞增殖、提高E玫瑰花形成率、促进细胞免疫功能,与人参、黄芪合用可增强人体免疫力,使乙肝患者机体自然免疫。另外,还可抑制胶原合成,抑制肝内炎症反应保护肝细胞,促进肝功能的改善和恢复。

2.4其他作用

虫草素还具有扩张支气管、平喘、祛痰、调节呼吸系统功能,防止肺气肿的作用,具有减轻慢性病的肾脏病变,减轻毒性物质对肾脏的损害,改善肾功能的作用。还具有增强骨髓生成血小板、红细胞和白细胞的能力,调节造血功能的作用。可降低血液中的胆固醇和甘油三酯,提高高密度脂蛋白,减轻动脉粥样硬化。虫草素还有直接抗病毒、调节中枢神经系统功能、调节性功能等作用。

虫草素的抗肿瘤机制

对肿瘤细胞RNA的抑制。虫草素可能有3种抑制肿瘤的机制:一是虫草素的游离羟基可以渗入肿瘤细胞DNA中而发生作用;二是抑制核苷或核苷酸的磷酸化、生成二磷酸盐和三磷酸盐的衍生物而抑制肿瘤细胞的核酸的合成;三是阻断黄苷酸胺化形成鸟苷酸的过程。现已证实,虫草素可掺入到RNA中,其磷酸化物3一ATP对L5178Y细胞中的依赖DNA的DNA多聚酶和B的活力无影响,但对核Ploy(A)多聚酶有很强的抑制作用,从而影响mRNA的形成,继而影响蛋白质合成。对子宫颈癌传代细胞(Hela)研究表明,虫草素可以使完全核糖体和核糖体的前体(45S)水平显著降低,18S核糖体的前体可以从45S核糖体中分裂,但32S核糖体的前体不能从中产生。tRNA的合成被降低,不均一核RNA的合成没有受到影响,但胞浆不均一核RNA的合成轻微减少。虫草素还能抑制人子宫颈癌传代细胞(Hela)的mRNA的转录,但对hnRNA和转运至细胞浆没有影响。通过对L1210细胞中核糖体RNA、非多聚腺苷酸不均一核RNA和多聚腺苷酸不均一核RNA的合成测定,表明虫草素能对各种形式的RNA起抑制作用,同时2一脱氧柯福霉素能增强这种抑制作用。对Novikof肝癌细胞研究发现,虫草素可以阻碍45SrRNA前体的合成,其浓度与hnRNA的合成相对抗,其活性形式3一脱氧腺苷一5一三磷酸盐对主要负责hnRNA合成的RNA聚合酶Ⅱ比对主要负责rRNA前体合成的RNA聚合酶I敏感”。研究结果表明,虫草素通过对肿瘤细胞RNA的抑制表现出抗肿瘤作用。

对肿瘤细胞DNA的抑制。通过虫草素与小牛胸腺DNA作用机制研究发现,DNA荧光光谱先是增强然后减弱,最终伴随轻微的蓝移,表明虫草素可能插人DNA双螺旋碱基对问。同时,磷酸盐的淬灭作用说明虫草素与DNA的磷酸基团也能发生作用,最后通过Sere-chad方程作图证明,虫草素与DNA可能存在两种作用方式,即插入方式和与DNA的磷酸基团结合。对信号传导通路的调节。研究发现,以黑素细胞刺激激素(a—MSH)处理s一9l鼠黑色素瘤细胞6d,可引起酪氨酸激酶(TPK)活性升高90倍,此酶信号传导途径的紊乱可以促使肿瘤的发生与发展,说明虫草素可以通过抑制此酶的活性,进而抑制肿瘤的形成。

另外,虫草素可在肿瘤增殖过程中抑制血管新生而呈现其抗癌作用,还可以通过激发肿瘤细胞中腺嘌呤核苷A3受体,从而抑制小鼠B16一BL6黑素瘤细胞和Lewis肺癌细胞的生长。开展虫草素对信号传导通路调节的研究将为攻克癌症打开又一个新的突破口。

讨论

虫草素临床应用前景广泛,但是通过对受孕小鼠行卵巢切除术并用孕酮替代维持受孕状态的研究证实,短期内重复注射虫草素可延缓小鼠胚泡植入子宫,然而12h或24h后的重复注射与单剂量使用则无效口,这说明虫革素进人体内有生物活性,但其作用短暂,并且需要维持一定浓度。因此,怎样维持虫草素在体内的浓度可能是它单独用于临床时的难题。另外,肿瘤细胞对虫草素敏感性的差异有待明确,增强虫草素对癌细胞靶向作用也须进行深入研究。

[参考文献]

[1]翁梁,温鲁.TLCS与HPLC对比测定虫草中虫草素和腺苷含量[J].江苏农业学报,2008,24(4):539540.

[2]刘春泉,宋江峰,李大蜻,等.虫草素的提取纯化及测定方法研究进展[J].食学,2007,28(11):596—599.

[3]傅明,乔文涛,侯军,等.蛹虫草中抗HIV一1活性成分的研究[J].南开大学学报(自然科学版),2007,40(5):92—95.
 
 
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